Регуляторное воздействие пептидов и нейроактивных липидов на процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток головного мозга

Цель Научного проекта – выяснение взаимного влияния нейроактивных пептидов и липидов на процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток. Основная задача проекта на заключительном этапе исследования – окончательная проверка гипотезы, что нейроактивные пептиды могут модулировать (усиливать или ослаблять) клеточные эффекты, вызванные нейроактивными липидами из семейства эндоканнабиноидов/эндованилоидов (нейролипинами) на уровне рецепции и/или внутриклеточной передачи сигнала. Необходимо установить ключевые звенья в передаче сигнала внутри клетки, которые ответственны за эффекты пептидов и липидов, изучаемых в данном проекте, и найти точки пересечения этих путей.

Основные результаты выполнения проекта.

1. С целью поиска новых активаторов рецептора GPR55 синтезированы: природный лиганд GPR55 рецептора – анандамид (этаноламид арахидоновой кислоты, AA-EA) и его аналоги с измененным этаноламинным фрагментом – с хлорэтиламином (AA-CEA) и циклопропиламином (AA-CPA), природный виродамин (VRD), арахидоноилсеротонин (AA-5HT), арахидоноилдофамин (AA-DA) и олеоилдофамин (Ol-DA). Все соединения вызывали апоптоз клеток феохромоцитомы PC12 через рецептор GPR55 в диапазоне EC50 6–80 мкМ. Наименьшей активностью обладал анандамид, наибольшей – производные дофамина, среди которых наиболее активным оказался нейролипин DHA-DA с EC50 6 мкМ.
2. Изучено защитное действие пептидов АКТГ(6-9)PGP, Pyr-Arg-Pro и KKRRPGP и нейролипинов DHA-EA, AA-Ser, AA-Gly и DHA-DA в моделях оксидативного стресса, вызванного пероксидом водорода (1) и трет-бутилгидропероксидом (2), а также в модели митохондриальной дисфункции, вызванной цианидом калия (3) на клетках нейробластомы человека SH-SY5Y. В модели 1 активны были пептиды KKRRPGP и AKTГ(6-9)PGP, в модели 2 – АКТГ(6-9)PGP, в модели 3 – АКТГ(6-9)PGP и Pyr-Arg-Pro. В модели 3 были наиболее активны нейролипины DHA-EA и AA-Ser, активность AA-Gly и DHA-DA была выражена слабее.
3. С помощью ингибиторного анализа определены основные звенья цепи передачи сигнала, приводящего к защитному эффекту пептида АКТГ(6-9)PGP и нейролипина AA-Ser от действия цианида. На уровне рецепции защитное действие пептида АКТГ(6-9)PGP от токсического действия цианида опосредовано взаимодействием (предположительно – аллостерическим) с рецепторами каннабиноидной системы GPR55 и GPR18, причём эти начальные звенья цепи регуляции пересекаются с теми же регуляторными элементами для нейролипина AA-Ser. При этом в первом случае оба вещества действуют однонаправленно, а во втором – в противоположные по направлению эффекта стороны. И пептид, и нейролипин действуют через пути передачи сигнала RAS и PKA-PKC, которые противодействуют апоптозу. Защитное действие пептида также чувствительно к ингибированию киназ MEK1,2, а защитное действие нейролипина – к ингибированию белка p38 – члена семейства MAPK. Этот анализ позволил выявить общие пути регуляции пептида и нейролипина, что было затруднительно обнаружить в экспериментах по совместной инкубации пептида и липида.
4. Эффекты сочетанного действия пептидов и нейролипинов на различные клеточные ответы SH-SY5Y можно суммировать следующим образом: цитотоксическое (проапоптотическое) действие – нет изменений; стимуляция пролиферации – активны комбинации AKTГ(6-9)PGP + AA-Ser (стимуляция), AKTГ(6-9)PGP + AA-Gly (ингибирование), AKTГ(6-9)PGP + DHA-DA и Pyr-Arg-Pro + DHA-DA (существенное усиление); дифференцировка – нет изменений; защитное действие от оксидативного стресса – уменьшение эффекта нейролипина (AA-Ser, DHA-DA). Анализ сочетанного действия пептида AKTГ(6-9)PGP и нейролипинв AA-Ser в условиях оксидативного стресса, индуцированного пероксидом водорода, методом Чоу-Талалай позволило установить, что при малых (≤ 1 мкМ) и больших (10 мкМ) дозах вещества проявляют антагонизм, тогда как при промежуточных концентрациях (5 и 1 мкМ, соответственно) наблюдается синергизм протективного действия веществ.
5. Изучено влияние пептида AKTГ(6-9)PGP на экспрессию генов основных путей регуляции ответа клетки на стрессорное воздействие пероксида водорода: NFkB, Nrf2 и MAPK. В рамках пути NFkB достоверное изменение экспрессии зафиксировано только для гена IkB (блокатор про-пролиферативного фактора транскрипции NKkB) при одновременном воздействии пептида и перекиси водорода. Уменьшение экспрессии этого гена согласуется со стимуляцией пролиферации пептидом и позволяют выдвинуть гипотезу о том, что про-пролиферативный ответ является значимым компонентом протекторной активности АКТГ(6-9)PGP. В рамках антиоксидантного пути Nrf-2 обработка перекисью водорода ожидаемо оказывала значительно стимулирующее действе на экспрессию самого фактора Nrf-2, а также генов глутатион S-трансферазы Gst, генов HO-1, Nqo1 и p53. При этом обработка пептидом без перекиси также оказывала выраженное стимулирующее действие на экспрессию генов Nrf2, Nqo1, Ho-1, Gst и p53. При одновременном добавлении перекиси и пептида экспрессия Gclc (ключевой фермент биосинтеза глутатиона) усиливалась, а генов p53 и Gst возвращалась к базовому уровню. В рамках сигнальных путей MAPK киназ статистически достоверные отличия зафиксированы практически для всех исследованных генов. При этом сочетанная обработка пептидом и перекисью приводила к усилению экспрессии генов Jnk и p38, но ослабляла экспрессию генов mkp1 и pp2a (по сравнению с повышением на фоне пептида) и mki67 (по сравнению с контролем и недостоверным повышением на фоне пептида). Усиление экспрессии киназ JNK и p38 согласуется с данными литературы об их участии в принятии решения о выживании или апоптозе клеток и в реакции на окислительный стресс.
6. Анализ сигнальных сетей с помощью сервиса Elsevier Pathway Studio для биоактивного пептида AKTГ(6-9)PGP и пептида вместе с нейролипинами в модели оксидативного стресса, вызванного пероксидом водорода позволил установить, что для пептида центральными интеграторами сигналов выступают белки JNK, CAT (каталаза) и p53. При добавлении ключевых компонентов передачи сигнала для нейролипинов сигнальная сеть значительно усложняется. Она характеризуется высокой сложностью и множественностью взаимных регуляций. При этом в качестве интеграторов сигнала нейролипинов и AKTГ(6-9)PGP выступают сигнальные пути NFkB, JNK и p53.

Таким образом, цель проекта была достигнута: удалось определить взаимное влияние биоактивных пептидов и липидов на клеточные ответы, установить ключевые звенья молекулярных механизмов ответов, амплитуда которых позволяла это сделать (пролиферация, защитное действие). Эти результаты стали важной составной частью комплексного проекта и позволили решить запланированные задачи в рамках трёхсторонней кооперации. Из-за ограничений, вызванных карантинными мероприятиями в связи с Ковид-19, произошла вынужденная задержка с оформлением финальной публикации по результатам проекта, в результате чего она находится в стадии принятия решения о публикации в редакции журнала Molecules.