Разработка принципов создания нейропротекторов нового поколения на основе гетероциклических сера- и селенсодержащих соединений с NO-генерирующим фрагментом
Цель выполнения НИР
Создание нового класса соединений на основе гетероциклических сера- и селенсодержащих соединений с NO-генерирующим фрагментом, обладающих уникальными физико-химическими свойствами и перспективных в плане применения в различных областях химии, а также для создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов, в том числе для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Выполнение НИР должно обеспечивать достижение научных результатов мирового уровня, подготовку и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов.
Планируемые результаты
- Общие способы введения NO-донорной группировки в молекулы биологически активных соединений.
- Способы синтеза N,N,N'-тризамещенных селеномочевин и Se,N,N,N'-тетразамещенных изоселеномочевин.
- Способы введения NO-донорной группировки в 1,2,4-тиадиазолы.
- Протоколы оценки нейрозащитного и токсического действия различных гетероциклических сера- и селенсодержащих соединений с NO-генерирующим фрагментом на клеточных моделях.
- Способы синтеза функционализированных 1,2,4-тиадиазолов, содержащих карбоксильные и аминогруппы.
- База данных по гетероциклическим сера- и селенсодержащих соединениям с NO-генерирующим фрагментом, синтезированным в ходе НИР.
- Лабораторные образцы различных гетероциклических сера- и селенсодержащих соединений с NO-генерирующим фрагментом, синтезированных и протестированных в ходе НИР.
- Монография по тематике проекта.
- Материалы лекций и образовательных курсов по результатам проекта.
- Прототип интернет-ресурса, содержащего материалы НИР, используемые в образовательном процессе.
- Лабораторные прописи синтетических процедур по классам синтезированных в ходе проекта гетероциклических сера- и селенсодержащих соединений с NO-генерирующим фрагментом.
- Программа внедрения результатов исследований в образовательный процесс.
- Отчет о НИР, содержащий обоснование развиваемого направления исследований, изложение методик проведения исследований, а также описание полученных результатов.
Основные результаты по этапам.
Этап 1.
1. Проведен анализ литературы по тематике НИР, сформулированы общие принципы создания гибридных соединений с донорами оксида азота и обоснован выбор конкретного типа NO-доноров.
2. Разработаны общие способы введения группировок, выделяющих оксид азота (NO-доноров) в молекулы биологически активных соединений.
3. Разработанные общие принципы введения NO-донорных группировок проверены на группе химических соединений различных классов, обладающих биологической активностью и сложной структурой. Синтезированы 1,3-динитроглицериновый эфир цефалоспорина G, 1,3-динитроглицериновые и нитроэтиленгликолевые эфиры полиненасыщенных жирных кислот, тринитрат шикимовой кислоты и 1-изопропил-4-метил-2-нитроксициклогексана (нитрат ментола).
4. Проведена проверка применимости способов введения NO-донорной группировки на классе природных простагландинов, включая прямое нитрование гидроксильных групп и присоединение NO-донорной группы с помощью линкера. Синтезированы 15-O-нитраты 11-дезоксипростагландина E1 и его метилового эфира прямым нитрованием гидроксильной группы исходных простагландинов. В качестве примеров линкерных соединений синтезированы 1,3-динитроглицериновые эфиры простагландинов. Они были получены этерификацией природных простагландинов 1,3-динитратом глицерина через активацию карбоксильной группы исходного простагландина путем превращения ее в реакционноспособные имидазолиды.
5. Составлен календарный план работ по НИР на весь срок выполнения Государственного контракта № 14.740.11.0810.
6. Разработана структура базы данных для соединений, синтезируемых в ходе выполнения проекта, и создан её макет.
Этап 2.
1. Разработан способ синтеза селеномочевин и на их основе ациклических производных изоселеномочевины как биоизостерных аналогов изотиомочевин. В качестве исходных соединений для их синтеза были использованы замещенные анилины. Из них, после превращения в формамиды, получали арилизоселенаты, которые реакцией с дибензиламинами превращали в селеномочевины. Последние алкилировали алкилйодидами и получали 1,1,2,3-тетразамещенные изоселеномочевины. По разработанным методикам синтезированы: селеноцианаты (4 структуры); селеномочевины (11 структур); бициклические и спиро-селено мочевины (2 структуры) и изоселеномочевины (7 структур).
2. Разработан метод синтеза неописанных ранее в литературе N,N-дизамещенных 5-амино-3-(2-оксопропил)-1,2,4-тиадиазолов – исходных соединений в синтезе нитратов 1,2,4-тиадиазолов. Метод основан на перегруппировке Боултона-Катрицкого изоксазольных тиомочевин в 1,2,4-тиадиа¬золы. Новым является впервые полученный 3-изотиоцианато-5-метил-изоксазол как стартовое соединение для конденсации с аминами. Этот подход позволил использовать недоступные ранее для этой перегруппировки вторичные амины и синтезировать уникальные N,N-дизамещенные тиадиазолы, содержащие кетогруппу с высоким выходом. Реакцией Шиффа с нитроэтаноламином получали целевые NO-донорные соединения (6 структур). Ещё одну группу замещённых тиадиазолов, несущих NO-донорную группу синтезировали восстановлением кетогруппы с последующим прямым нитрованием азотной кислотой. По этой схеме было синтезировано 7 структур.
3. По материалам данной работы были опубликованы две статьи и 3 тезисов сообщений на конференциях и симпозиумах. Кроме того, в настоящее время собран экспериментальный материал и готовятся к публикации ещё 2 статьи.
4. Проведён анализ публикаций в открытой печати и патентов по тематике этапа. Было установлено, что среди множества работ по селеносодержащим соединениям не было описано получение веществ, составляющих предмет исследования данного проекта. Патентноспособными являются как сами N,N,N'-тризамещенные селеномочевины, Se,N,N,N'-тетразамещенные изоселеномочевины и замещённые 1,2,4-тиадиазолы, но и их NO-донорные производные, а также функционализированные аналоги, содержащие дополнительные фармакофоры. В патентное ведомство Российской Федерации отправлена 1 заявка на патент.
5. Для оценки фармакологической активности синтезированных соединений предполагается использовать на первом этапе клеточные культуры, что позволяет одновременно анализировать библиотеки синтетических веществ в достаточно экономном варианте по сравнению с тестами на лабораторных животных. В соответствии с календарным планом были разработаны протоколы анализа цитотоксической активности синтезированных веществ на клетках глиомы крысы С6 и нейрозащитного действия данных соединений на первичных культурах гранулярных нейронов мозжечка крысы. Оба теста будут использованы для оценки фармакологической активности синтезированных соединений на последующих этапах проекта.
Этап. 3.
1. Проведены биологические испытания синтезированных соединений на нейрозащитное действие. Показано, что модификация аминотиадиазольных производных приводит от исходных малоактивных кетопроизводных через умеренно активные. гидроксипроизводные к высокоактивным нитроксипроизводным 5-амино-1,2,4-тиадиазола. По результатам этих исследований были найдены неописанные в литературе соединения с двойственным спектром физиологической активности, которые в зависимости от концентрации либо ингибировали захват кальция синаптосомами, либо стимулировали его.
2. Проведена оценка цитотоксической активности синтезированных ранее соединений. В синтетической библиотеке замещенных изоселеномочевин, изотиомочевин и селеномочевин найдены вещества с цитотоксической активностью по отношению к клеткам глиомы С6. Среди группы исследованных производных амино-1,2,4-тиадиазола, которые все проявляли умеренную цитотоксическую активность, найдены наиболее активные соединения. Установлено, что нитрование гидроксильной группы замещенного амино-1,2.4-тиадиазола приводит к усилению цитотоксической активности.
3. Разработаны способы функционализации 5-амино-1,2,4-тиадиазола путём введения молекулярных фрагментов, содержащих гидрокси-, карбокси- и аминогруппы. Получены неописанные в литературе производные, которые обладают искомой нейропротекторной и (или) когнитивно-стимулирующей активностью. Указанные функционализированные аминотиадиазолы можно использовать для дальнейшей модификации молекулы (например, реакцией с разнообразными жирными кислотами), и, следовательно, могут служить основой для создания гибридных многофункциональных соединений.
4. Выполнен компьютерный анализ отношений структура – активность на синтезированном классе соединений. Создана база данных, содержащая данные о молекулярных структурах производных изомочевин; для каждого соединения базы данных рассчитаны 4 блока молекулярных дескрипторов (всего отобрано 173 дескриптора) и в каждом блоке дескрипторов выделены главные компоненты; в пространстве главных компонент проведено сравнение результатов древовидной кластеризации и кластеризации методом к-средних для каждого блока дескрипторов. Результатом расчетов явилось выделение кластеров потенциально активных молекул в каждом блоке дескрипторов.
Этап 4.
1. Для создания новых классов гибридных соединений на основе функционализированных 1,2,4-тиадиазолов разработаны различные методы конъюгации этих соединений с биологически важными аминами и карбоновыми кислотами. Для этого использовали кето-, гидроксильную и амино-функциональные группы замещённых 1,2,4-тиадиазолов. Реакцией замещённых 1,2,4-тиадиазолов, содержащих кето-группу, с гидроксиламином гидразином и замещенными гидразинами синтезированы оксимы и гидразиды 1,2,4-тиадиазолов. Ацилированием 2'-гидроксипропильного радикала в замещённых 1,2,4-тиадиазолах биоактивными карбоновыми синтезированы эфирные производные этих тиадиазолов с простагландинами, полиненасыщенные жирными кислотами, рицинолевой кислотой и другими кислотами. Амидные производные указанных кислот синтезировали конъюгацией их активированных производных с замещёнными 1,2,4-тиадиазолами, содержащими вторичную аминогруппу. Разработаны удобные лабораторные методики синтеза указанных соединений.
2. На основе разработанных в ходе выполнения проекта синтетических процедур синтезировано несколько библиотек замещённых 1,2,4-тиадиазолов и селеномочевин, суммарно включающих более 300 новых соединений.
3. Скрининг соединений синтетических библиотек осуществлён с помощью двух основных тестов: определение нейрозащитного эффекта веществ на модели ингибирования глутамат-зависимого захвата 45Ca2+ в синаптосомы коры мозга крыс и определение цитотоксического эффекта по отношению к клеткам глиомы С6 крысы. Отобранные в первом тесте наиболее активные соединения были затем испытаны в опытах по ингибированию пролиферации трансформированных клеток. Отобраны для дальнейшего изучения наиболее перспективные соединения, которые могут составить основу для разработки новых нейрозащитных лекарственных средств, сочетающих способность уменьшать нейродегенеративные процессы с цитотоксическим действием на опухолевые клетки.
4. Для сформированной на основе анализа всего массива новых соединений данного этапа сформирована база данных для компьютерного анализа отношений структура–активность, насчитывающая 168 соединений. Определён коэффициент схожести структур для данной базы, который равен 0,48. Проведено выделение из базы данных групп соединений (кластеров) для дальнейшего количественного предсказания исследуемого свойства, исходя из информации о структуре молекулы. В результате база данных была разбита на 17 кластеров, коэффициенты сходства каждого из которых находились в пределах от 0,68 до 0,89, что говорит о большей однородности полученных кластеров по сравнению с базой данных в целом. Эталонные соединения каждого кластера позволяют наметить пути дальнейшей оптимизации структур.
5. Для всех синтезированных в ходе проекта соединений сформирована единая база данных структур, включающая структурные и брутто-формулы, значения молекулярной массы, химические названия, данные по биологической активности, номера спектров ЯМР, шифры соединений и другую информацию. В базе организован поиск соединений по структурным фрагментам молекулы, что позволяет быстро формировать библиотеки веществ для проведения скрининговых исследований и компьютерного или физико-химического анализа.
Этап 5.
1. Разработаны программы трех общеобразовательных курсов для подготовки аспирантов в НОЦ ИФАВ РАН и студентов в НОЦ ИБХ РАН по актуальным вопросам биоорганической химии. Подготовлены и прочитаны три лекции, в которых представлены разработки авторов проекта по новому направлению конструированию лекарственных препаратов, а именно – концепции гибридных многофункциональных соединений, содержащих, в том числе, доноры оксида азота.
2. Разработаны научно-методические материалы для общеобразовательных курсов лекций для студентов и аспирантов, включающие список рекомендованной литературы для самостоятельного изучения, иллюстративные и информационные материалы, содержащие основные положения, рассматриваемые в данной лекции, а также слайды, сопровождающие излагаемый материал. Также подготовлены иллюстративные материалы к лекциям по рассмотрению концепции авторов проекта по основам конструирования лекарственных препаратов нового типа, и в том числе, разработанные в ходе выполнения данного проекта.
3. Подготовлена монография «Химическая модификация биоэффекторных липидов. Подходы к новым типам лекарственных препаратов». Авторы – В.В. Безуглов и И.В. Серков. В монографии рассмотрены методы химической модификации природных биоэффекторных липидов и концепция гибридных многофункциональных биологически активных веществ.
4. На основании ранее разработанных методик химического синтеза целевых соединений созданы 22 лабораторные прописи синтетических процедур, содержащие разделы: Область применения, Принцип метода, Реактивы, Посуда и оборудование, Проведение реакции, Примеры синтезированных соединений. Указанные прописи могут быть использованы при проведении лабораторных работ аспирантами во время обучения в аспирантуре в рамках специальных курсов органического синтеза.
5. Разработаны материалы информационного и методического характера для интернет-ресурса по адресу: http://oxylipin.ibch.ru/default.aspx. В разделе «Проекты» размещена информация о целях и задачах проекта, приведены основные результаты, достигнутые на каждом этапе, список публикаций по проекту и автореферат диссертации доктора химических наук, защищенной в рамках проекта. В разделе «Лицей» размещена программа образовательного курса «Биоэффекторные липиды», вопросы к экзамену и слайды к каждой лекции.
Публикации по проекту
Прошин А.Н., Трофимова Т.П., Бачурин С.О. Новые тетразамещенные тиомочевины с N-иминоэтильным фрагментом. // Известия АН. — 2011. — № 11. — C. 2385-2386.
Серков И.В., Прошин А.Н., Петрова Л.Н., Бачурин С.О. Новые 1,2,4-тиадиазолы с NO-генерирующим фрагментом. // Доклады Академии наук. — 2010. — Т. 435. — № 4. — С. 479–481.
Прошин А.Н., Серков И.В., Петрова Л.Н., Бачурин С.О. "Новые спиропроизводные изотиомочевины в ряду 1,3-тиазина, обладающие нейрокорректирующей активностью. // Известия АН. — 2011. — № 11. — С. 2389-2390.
Прошин А.Н., Серков И.В., Бачурин С.О. Синтез селеновых аналогов 1-аза-бицикло[3.3.1]нонана.// Доклады Академии наук. — 2012. — Т. 443. — № 2. — C. 189-190.
Безуглов В.В., Серков И.В. Избирательная защита гидроксильных групп в природных простагландинах типов E и F. // Химия природных соединений. — 2012. — № 2. — 260-265.
Серков И.В., Грецкая Н.М., Безуглов В.В. Аналоги 2-арахидоноилглицерина, содержащие NO-донорный фрагмент. // Химия природных соединений. — 2012. — №3. — С. 334–336.
Серков И. В., Прошин А. Н., Петрова Л. Н., Грецкая Н. М., Безуглов В. В., Бачурин С. О. Новые гибридные соединения на основе аминопроизводных 1,2,4-тиадиазола и докозагексаеновой кислоты. // Доклады Академии наук — 2012. — Т. 447. — № 1. — С. 49–52.
Серков И.В. "Синтез и свойства биологически активных соединений, содержащих NO-донорный фрагмент." Диссертация на соискание степени доктора химических наук.