Цель проекта: установить механизм индукции ацилдофаминами дифференцировки клеток и критические параметры клеток, необходимые для реализации данного эффекта.
В рамках первого годового этапа была проверена способность синтезированной библиотеки ацилдофаминов – дофаминамидов арахидоновой, докозагексаеновой, олеиновой кислот, арахидоноил О-метилдофамина, тирамина, норадреналина и арахидоноилдофамина и их аналогов, содержащих дополнительный молекулярный фрагмент между дофамином и остатком арахидоновой кислоты в виде гамма-аминомасляной кислоты и этаноламна индуцировать дифференцировку крысиных глиомы линии C6 и феохромоцитомы линии PC12. Установлено, что все вещества, кроме производного тирамина, обладают дифференцирующей активностью. Для линии PC12 зафиксирована нейрональная дифференцировка с экспрессией маркера Tubb3, остановкой роста и появлением отростков с максимальной длиной 334 мкм. Для линии C6 была зафиксирована частичная нейрональная дифференцировка с экспрессией мРНК маркера предшественников нейронов Neurod1, S100b, остановкой роста и исчезновением астроглиальных (Gfap) и олигодендроцитарных (Mbp) маркеров; медианная длина отростков для данной линии увеличивалась с 30 мкм до 70-80 мкм. При непрерывной обработке клеток веществами в течение двух недель дифференцировка была обратимой, при импульсной обработке в течение шести месяцев – необратимой.
Установлено, что основной мишенью ацилдофаминов является цитоплазматический рецептор GPR55, сигнал от которого передается через фосфолипазу С, IP3R, кальций, кальмодулин и протеинкиназу CaMKIV на фактор транскрипции CREB, который обеспечивает экспрессию NO-синтазы и дифференцировку за счет сигнальной активности генерируемого ею оксида азота. Полученные данные о нейрональной дифференцировке клеток под действием ацилдофаминов являются пионерскими. Роль GPR55 в качестве рецептора ацилдофаминов показана и доказана впервые.
Основные задачи этапа Проекта на 2017 г. заключались в: 1) уточнении требований к структуре молекулы ацилдофамина для проявления им дифференцирующей активности; 2) установлении роли окисления в индукции дифференцировки ацилдофаминами; 3) выяснении роли интерлейкина-6 (IL6) в индукции дифференцировки клеток C6 и PC12; 4) верификация нейрональной и астроцитарной дифференцировки под действием ацилдофаминов; 5) верификации компонентов сигнального пути при индукции дифференцировки ацилдофаминами. С использованием синтезированных аналогов природных ацилдофаминов показано, что для индукции дифференцировки молекула ацилдофамина должна содержать катехольную группу, причем более важную роль играет свободная гидроксильная группа в 4-м положении бензольного кольца. Специальными экспериментами показано, что неспецифическое окисление не задействовано в индукции дифференцировки ацилдофаминами. С помощью иммуноцитохимии показано появление белковых маркеров дифференцировки C6 в астроцитоподобные клетки и PC12 в нейроноподобные под действием ацилдофаминов, что согласуется с изменениями на уровне мРНК, обнаруженными на предыдущем этапе Проекта. Также было подтверждено участие фактора транскрипции CREB в передаче дифференцирующего сигнала ацилдофаминов.
Таким образом, в результате выполнения этапа была подтверждена способность ацилдофаминов индуцировать обратимую астроцитарную дифференцировку клеток глиомы линии C6 и обратимую нейрональную дифференцировку клеток феохромоцитомы линии PC12. Активность молекул является специфической и требует наличия немодифицированной катехольной группы; окисление остатка дофамина инактивирует молекулу. Сигнал ацилдофаминов передается через рецептор GPR55 или CB1 на фактор транскрипции CREB, который запускает экспрессию интерлейкина 6 и через аутокринную активность этого цитокина обеспечивает дифференцировку.